Insulinherstellung, alte Ampullen

Gut Ding will Weile haben – das gilt auch bei der Insulinherstellung: Etwa ein Jahr dauert es, bis das lebenswichtige Hormon biotechnologisch, d.h. mit Hilfe von Mikroorganismen, hergestellt ist und weltweit für mehr als 300 Millionen Menschen mit Diabetes zur Verfügung steht.

Seit den 1920er-Jahren wird Insulin zur Behandlung von Diabetes verwendet. Es hat allerdings mehr als 30 Jahre gedauert von der Entdeckung der Pankreasfunktion durch eine kanadische Forschergruppe bis zum Beginn der industriellen Insulinherstellung. Was genau Insulin ist, welche Struktur es hat und wie es wirkt, blieb für Jahrzehnte unklar. Im Laufe der Geschichte war Insulin in verschiedener Hinsicht die «Nummer Eins» als Vorreiter für bedeutende Erkenntnisse: Unter anderem war es das erste Protein, dessen chemische Formel identifiziert war. Es war das erste Protein, von dem man die exakte räumliche Struktur (die sogenannte Röntgenstruktur) gekannt hat. Ausserdem war es das erste gentechnisch hergestellte Medikament.

Erste Apparaturen zur Insulinherstellung in Dänemark
Erste Apparaturen zur Insulinherstellung in Dänemark

Zu Beginn wurde Insulin aus Tieren isoliert. Das erste Präparat für die bis dahin nicht therapierbare Krankheit wurde 1922 in den USA eingeführt und stammte aus Bauchspeicheldrüsen von Rindern und Schweinen. Dies war aus verschiedenen Gründen problematisch: Einerseits ergaben sich durch die aufwendige Verarbeitung zu geringe Mengen Insulin für klinische Anwendungen.
Für ca. 100 – 200 g Insulin wurden 1 kg Bauchspeicheldrüse benötigt, das heisst es mussten ungefähr 50 Schweine verarbeitet werden, um den Jahresbedarf eines einzelnen Diabetikers zu decken. Zudem erkannten die Immunsysteme vieler Patienten die tierischen Insuline als körperfremde Stoffe und rea­gierten daher mit Abwehrmechanismen. Weiter waren mehrere tägliche Injektionen erforderlich, um eine adäquate Blutzuckerkontrolle zu gewährleisten, da das Insulin nur kurz wirksam war. Die sauren Lösungen schmerzten bei der Injektion. Eine saure Lösung war aber notwendig für die Löslichkeit der Fremdproteine und zum Schutz des Insulins vor dem Abbau durch die als Verunreinigung verbliebenen Enzyme der Bauchspeicheldrüse.

Biotechnologie – ein neues Kapitel

Mit den Möglichkeiten der Biotechnologie in den 1980er-Jahren begann dann ein gänzlich neues Kapitel. Die Herstellung von Insulin durch gentechnisch veränderte Hefezellen oder Bakterien bedeutete, dass Insulin praktisch in unbegrenzten Mengen zur Verfügung stand. Die Produktion von biotechnologisch erzeugtem Insulin war und ist allerdings ein relativ aufwendiger Prozess und dauert insgesamt etwa ein Jahr.
Ungefähr die Hälfte des weltweiten Insulinbedarfs wird heute im dänischen Kalundborg durch Novo Nordisk, dem weltweit grössten Insulinproduzenten hergestellt. Anders als Sanofi-Aventis oder Eli Lilly, welche 1982 als erster Hersteller ein gentechnisches, von Escherichia-coli-Darmbakterien erzeugtes Humaninsulin auf den Markt brachte, verwendet Novo Nordisk zur Insulinherstellung Zellen der Hefe Saccharomyces cerevisiae (die Hefe, mit der auch Bier hergestellt wird).
Die Hefezelle, ein gut bekannter und hochentwickelter Organismus, ist den menschlichen Zellen ähnlicher als Bakterien. Sie wächst auch sehr gut in einem einfachen Nährmedium, das lediglich Zucker, Vitamine und einige Salze enthält.

Sind Smart-Insuline die Zukunft der Insulintherapie?

Es tönt fast zu schön, um wahr zu sein: Der Einsatz von sogenannten «Smart-Insulinen» könnte künftig das Blutzuckermessen, das Abschätzen und Berechnen von Kohlenhydraten und das Festlegen der Insulindosierung überflüssig machen. – Wie soll das funktionieren?
Unter «Smart-Insulinen» (sie werden auch «Glucose-Responsive Insuline» genannt) versteht man Insulinpräparate, die wie üblich mittels Spritze oder Patch von aussen dem Körper zugeführt werden. Dabei wird ein Insulindepot unter die Haut gesetzt, in dem das wirksame Insulin aber zusätzlich in eine Hülle (im Fachjargon «Matrix») eingepackt ist. Je nach Blutzuckerspiegel setzt diese Matrix automatisch mehr oder weniger Insulin aus dem Depot frei. Ist der Blutglukosespiegel hoch, wird mehr Insulin ins Blut abgegeben. Ist er tief, setzt die Hülle entsprechend weniger Insulin frei. Auf diese Weise wird der Blutzucker von selbst reguliert und im Zielbereich gehalten.
Damit dies funktioniert, sind hochkomplexe Systeme zu entwickeln. Bei der Matrix dürfte es sich um Mikro- oder Nanogel, Mikrokapseln oder Ähnliches handeln. Die Steuerung der Insulinfreisetzung soll auf biochemischen Prozessen beruhen, die dem Blutzuckerspiegel entsprechend die Matrix verändern und so die Insulinfreisetzung aktivieren oder hemmen.
Das alles tönt sehr futuristisch, fast wie Science-Fiction. In der Tat sind aber mehrere grössere und kleinere Pharmaunternehmen in der Entwicklung solcher Systeme stark engagiert. Die bisherigen Forschungsergebnisse sind vielversprechend. Ob aber je ein praxistaugliches, sicheres, den Körper nicht belastendes Smart-Insulin zugelassen und marktreif sein wird, werden wir erst in mehreren Jahren erfahren.
Dr. med. A. Spillmann

Fermentoren
Fermentoren

Seit ein paar Jahren sind Bestrebungen im Gange, die Herstellungsmethoden mit E. coli-Bakterien mit denen der Hefe zu vereinen. Wissenschaftler haben hierzu ein Verfahren mit einer robusten Hefe namens Pichia pastoris entwickelt mit dem Ziel, die Ertragsmenge bei der Insulinherstellung zu steigern.

Herstellungsschritte bei der Insulinproduktion

Zur Herstellung des Insulins bei Novo Nordisk wird in einem ersten Schritt das Insulin-Gen aus menschlicher DNA (Molekül, welches Träger der Erbinformation ist) in die Hefezelle eingeschleust. Anschliessend wird die Zellvermehrung zunächst im Glaskolben im Labor und danach in grossen Kesseln (sog. Fermentoren) durch Wärme und Nährstoffe vorangetrieben. Jede halbe Stunde verdoppelt sich die Zellzahl. Innert weniger Wochen vermehren sich die Zellen so auf ein Volumen von mehreren 10 000 Litern. Während dieser Zeit produzieren die Zellen Vorläufer des Insulins. Hefe kann Fremdproteine direkt in das Nährmedium abgeben, daher müssen sie anders als E. coli-Bakterien nicht noch erst aufgebrochen und chemisch bearbeitet werden.

Zellvermehrung

Die Insulin-Vorläufer werden aus dem abgepumpten Sud durch Zentrifugieren und mittels einer sogenannten Absorptionssäule isoliert. Die noch intakten Hefezellen werden danach inaktiviert und entsorgt. Nach der Absorption werden die so gewonnenen Insulinmoleküle herausgelöst und durch Kristallisation und Zentrifugation von unerwünschten Begleitstoffen getrennt und zu den verschiedenen Insulinsorten zusammengesetzt: Zu Humaninsulin, oder seit den 1990er Jahren auch zu rekombinanten Insulinanaloga, d. h. gentechnologisch veränderten Proteinen, die dem menschlichen Insulin ähnlich sind. Durch eine Änderung oder einen Tausch von Aminosäuren resultiert eine veränderte Wirkung. Je nachdem wirkt das Insulin schneller und kürzer bzw. langsamer und länger. Ziel ist eine sogenannte physiologische Wirkung. Das heisst eine Insulinwirkung, die derjenigen des in der menschlichen Bauchspeicheldrüse produzierten Insulins möglichst nahe kommt. Damit das Insulin im Körper bio­logisch aktiv ist, muss es einen hohen Reinheitsgrad aufweisen und fehlerfrei gefaltet sein. Die Umwandlung der Insulinvorstufe in wirksames Insulin sowie die perfekte Reinigung des Produktes sind dafür entscheidend.

Reinigung und Modifizierung

Wichtige Zusatzstoffe

Das fertige Insulin wird anschliessend gefriergetrocknet, und in diesem Zustand als weisses Pulver ist es tiefgekühlt beinahe unbegrenzt haltbar. Das Insulinpulver wird danach mit Zusatzstoffen und Wasser zu einer sterilen Flüssigkeit gemischt.
Alle Insulinzubereitungen sind wässrige Formulierungen. Diesen werden verschiedene Konservierungsstoffe und desinfizierende Substanzen beigefügt wie z. B. Phenol oder Cresol, welche für die Sterilität sorgen und verantwortlich sind für den typischen Geruch des Insulins. Als Lösungsmittel wird ausschliesslich Wasser für Injektionszwecke verwendet.

Phenol wirkt in Kombination mit Metacresol gleichzeitig als Stabilisator für die Insulinkristalle. Das heisst, dank diesen Stoffen bleibt die Beschaffenheit der Insulinkristalle erhalten. Als Stabilisator sowohl für Lösungen als auch insbesondere für Suspensionen werden Zinkionen verwendet, die als Zinkoxid, Zinkchlorid oder Zinkacetat zugesetzt werden.

Abfüllung

Den sogenannten langwirksamen Insulinen werden Verzögerungsstoffe zugesetzt, welche die Geschwindigkeit der Aufnahme ins Blut verzögern und somit den Beginn sowie die Dauer der Insulinwirkung verlangsamen. Einen ersten Schritt in diese Richtung erlaubte bereits der 1946 entdeckte Zusatzstoff Protamin, welcher an Insulin gebunden als sogenanntes NPH-Insulin (neutrales Protamin Hagedorn) die schwer berechenbaren Zink-verzögerten Insuline teilweise ablösen konnte. Protamin besteht zu ca. 90 % aus der Aminosäure Arginin und wird aus dem Sperma diverser Fische gewonnen.

Etikettierung

Natriumhydrogenphosphatsalze oder Natrium­acetat werden als sogenannte Puffer verwendet, um den pH-Wert konstant zu halten.
Alle heute verwendeten Substanzen sind in der zugesetzten Menge gesundheitlich unbedenklich. Nur in Ausnahmefällen gibt es Patienten, die auf diese Stoffe allergisch reagieren.

Nach dem Abfüllen unter strengsten hygienischen Vorkehrungen in vorgefertigte Penpatronen oder Ampullen, erfolgt die länderspezifische Beschriftung und Verpackung der Präparate. Danach werden sie mit Kühltransporten in die einzelnen Länder geliefert und sind somit nach einem etwa einjährigen Herstellungsprozess für Menschen mit Diabetes zur Verwendung bereit.

(Siehe auch Artikel «Insuline im Überblick» aus «d-journal» 251/18)

Autor: Anne-Malin Nicolaisen